牛初乳粉中IgG蛋白的分离纯化及检测方法

（1）牛初乳样品预处理

① 去除脂肪及酪蛋白：

A. 取3g牛初乳粉溶于20mM PB中，漩涡震荡混匀充分溶解，定容至30mL ，浓度为1g/mL。

（可滴加少许消泡剂，约4μL/mL）

B.用6M HCl调pH至4.5，37℃ 水浴35min，9000r/min 离心20min，弃沉淀，保留上清。

② 去β-乳球蛋白：

将上述上清用10M NaOH回调pH至7.0，9000r/min 离心20min，弃沉淀，保留上清。

③ 去除小分子杂蛋白及脱盐浓缩样品：

将上述上清倒入30kDa超滤管中，8000r/min 离心10min，收集截留液。

④ 除微生物杂质：

将截留液过0.45μm滤膜，准备上样。

（2）Protein G 4FF亲和纯化（280nm）

（3）SDS-PAGE电泳测定纯度

① 10×电泳缓冲液配置（1L）：

② 上样：

按4:1=样品：5×Loading Buffer 的比例加入上样缓冲液混匀，沸水浴5-10min，据样品情况选择上样量，Marker 5μL/孔，浓缩胶80V 20min，分离胶120V 60min电泳。

③ 染色及脱色：

用染色液染色30min，用蒸馏水清洗后，查看结果。

（4）BC-10重力柱脱盐（8.3mL）

液相色谱检测

①超滤浓缩 → ②-20℃预冻干 → ③-80℃真空冻干 → ④冻干样品复溶纯度色谱检测 → 蛋白冻干-20密封保存。

采用月旭Welchrom^® PreCot Protein G 4FF（5mL，00081-12012）与月旭Welchrom^® BC-10重力柱（8.3mL，00051-32022）两种层析柱进行二次层析，可以使样品纯度达到97%，再经30kD超滤管进行浓缩可进一步提升样品纯度，经月旭Xtimate^® SEC-300（7.8×300mm，5μm）色谱检测纯度达到99.86%。