液相色谱，你问我答（七）

四氢呋喃(THF)是反相色谱中洗脱能力极强的溶剂，比甲醇和乙腈都强很多。在流动相中加入THF能改善某些难分离的物质对的分离度。但THF不稳定，容易降解生成具有很强反应活性的过氧化物，能与分析物反应生成新化合物，导致拖尾、峰分裂和鬼峰产生。高反应活性的过氧化物还可以和填料固定相发生化学作用，这个过氧化物对柱子会有损伤，而且这种损伤是随时间累积的。THF保质期一般规定是6个月，放得越久，里面产生的过氧化物含量越大，应该避免使用生产日期已很久的THF溶剂，而且最好将THF冷藏、干燥和避光保存，使用前最好能检测一下过氧化物的含量。

在反相色谱中随着pH的增加，酸性化合物保留时间缩短，而碱性化合物延长；

缓冲液可以缓冲溶液pH的改变，缓冲液的定义是加入少量的酸或碱时能缓冲pH，就是说添加酸或碱时pH的变化很小。这个保持pH的能力就叫做缓冲能力，它是由缓冲液的浓度和缓冲盐的pKa决定的，缓冲盐在pKa附近的缓冲能力最大。表1列出的是液相中一些常用的缓冲盐的pKa。注意这是在水中测的，没有加有机溶剂。当加入有机溶剂时，pKa会有所变化，但是通常所有化合物的pKa，包括你的分析物的pKa都会有一样的变化。

对于液相常用浓度来说，缓冲液应维持在缓冲盐的pKa的1.5个pH单位左右，当浓度特别稀的时候，如低于5mM，就要把范围缩小，大概+/-1个pH单位。

表1：常用缓冲盐的pKa值（25℃）

建议在开发方法的时候首先要选择缓冲盐和 pH范围，然后用溶液的选择性微调分离。这个策略快速而高效，而且可以让你避免陷入缓冲液pH的泥潭。

1）建议温度设置在25℃-40℃，适当的柱温保持良好的保留时间的重现性，一定程度上提高柱效，增加分离度。

2）柱温过低，流动相的粘度下降，色谱柱的背压降低。

3）柱温太高，与检测器之间温差太大，使峰变形，加快离子对试剂或缓冲盐对硅胶基质的攻击，硅胶溶解，缩短色谱柱的寿命；柱温太低，使得需要制冷的柱温箱，硬件要求太高，不利于方法的推广。

4）温度的改变会导致保留时间漂移，如果仪器自动进样过夜或过周末，就会发现保留时间随着实验室温度的改变而产生漂移，显然这种问题用柱温箱就可以避免。 

1）检测器对样品和流动相的吸收差值就是峰的响应值，溶剂峰就是配置样品的溶剂进入系统后，所产生的吸收与流动相吸收的差值，一般是最前面的峰。

2）只要进样就会有系统峰出现，和使用什么溶剂没有什么关系，如果是梯度，一般在梯度回到起始比例平衡系统的时候也会有系统峰，任何物质都不应该在这之后出峰。

3）溶剂峰与检测时的波长有关系，波长的选择可以使溶剂峰出现或隐蔽。

4）流动相和稀释剂选择的时候一般就要求使用在检测波长没有响应或响应很低的试剂，选择稀释剂的时候应尽可能的选择流动相。

如果倒峰并不干扰试验，所以，只要忽视它就可以了。当然，如果你在控制环境指标，那么就要仔细考虑了。

倒峰是溶剂在该波长下比流动相的吸收更弱，所以有峰就代表可能有物质吸收。峰代表着样品与流动相的差别，与正峰还是倒峰，是否保留无关。对于我们大部分人来说，并不担心这一点。我们知道这只是由于溶液与流动相的差异导致的。因此我们要做的是找出是什么导致了图谱中出现了额外的峰。这个峰是倒的给我们提供了有用的信息，这些峰是有样品溶液与流动相的差别导致的。有可能是成分不同，也有可能是pH不一样。只有非常小心的用流动相配制样品，才能避免出现倒峰。

要确定那个多出来的峰时来源于外来物还是其他地方，只要进一个标准品就好了。如果是外来物质的峰，那么在标准品中就不会有峰。这个峰在进标准品甚至是流动相的时候都有。如果换了样品还是出现这种现象，那么就应该把样品排除嫌疑范围了。所以，要关注到仪器或者流动相本身了。如果多出来的峰是正峰，要考虑进样器，注射器，样品瓶盖或类似的有没有污染。流动相本身和所有与其接触的部件都有很大可能是问题的根源。

关于漂移问题：

1）温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定。

2）流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等。

3）柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡。

关于快速变化问题：

1）流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定。

2）泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。

3）流动相不合适，解决办法为改换合适的流动相或预先混合流动相。

如果你是手动进样，确定下你是不是忘了扳动六通阀（使用的进样器是六通阀），然后检查下色谱柱压力是否正常（有没存在没打起液体的情况，是否有漏液现象），最后复查一下分析方法（如流动相配比、检测波长、样品配制浓度等）是否可靠。分析方法是否适合待测样品，是否存在保留过强导致未洗脱的情况。

这很有可能是流通池内有气泡。请先停泵来进行确认，如果毛剌消失，则很有可能是由于流动池内有气泡。需要冲洗流动池。如果毛剌仍然存在，则需检查检测器本身的电噪音有关，或者色谱内部有污染；若仪器系统进入气泡，可以用纯的异丙醇或者纯甲醇有机相进行冲洗排除，色谱柱污染，故对色谱柱进行强洗脱溶剂进行冲洗。

1)柱温波动：(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器)。控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器。

2)流动相不均匀：(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移)。使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂，流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。

3)流通池被污染或有气体：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用硝酸(不要用盐酸)。

4)检测器出口阻塞：(高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线)取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。

5)流动相配比不当或流速变化：更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

6)柱平衡慢特别是流动相发生变化：用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时，在分析前用10~20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。

7)流动相污染、变质或由低品质溶剂配成：检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及 HPLC 级的溶剂。

8)样品中有强保留的物质(高K值)以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐升高的基线：使用保护柱，如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。

9)使用循环溶剂，但检测器未调整：重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。

10)检测器没有设定在最大吸收波长处：将波长调整至最大吸收波长处。

可能的原因：

1）泵头中有气泡

2）单向阀顺坏

3）柱塞密封圈损坏

4）脱气不充分

5）系统漏液

6）使用了梯度洗脱